黑色素瘤是澳大利亚最危险的皮肤癌之一,确诊后五年内死亡率为85%。其在澳大利亚的发病率不仅是世界上最高的,而且在持续上升。现在每年会诊断出11000例新发黑色素瘤的病例,预计到2020年会达到每年15000例。皮肤癌与细胞代谢异常有关,如果能在皮肤癌的早期鉴定出来,可以采取治疗措施防止其进入致命的转移期。最近的先进光学技术发展使得皮肤癌的早期诊断能力大大加强。这样的早期诊断成像技术包括反射共聚焦显微镜,多光子显微镜,光学相干成像,拉曼光谱和多模式成像技术。在过去十年中,荧光寿命成像(FLIM)与多光子显微镜联用在表征/诊断皮肤疾病,特别是黑素细胞病变方面具有很大的优势。
FLIM是一种独特的工具,能够测量和区分单个细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的游离和蛋白质结合形式的百分比。NADH及其磷酸化形式NADPH是参与细胞能量产生的天然辅酶。 NADH和NADPH的还原形式的荧光寿命取决于与蛋白质的结合。结合的NADH寿命在1.2ns至4ns的范围内,未结合的NADH寿命在约300ps至500ps的范围内。结合和未结合的NADH的浓度比取决于代谢的类型:当细胞处于氧化磷酸化状态时,结合/未结合比例高于糖酵解状态。因此,衰变成分的相对幅度随着代谢的类型而变化,平均荧光寿命也随之变化。由于正常细胞优先运行氧化磷酸化,而肿瘤细胞运行糖酵解,荧光衰减参数的相应变化具有区分健康细胞和肿瘤细胞的潜力。NADH荧光寿命与NADH / FAD氧化还原比值相结合还可以用于预测乳腺癌的药物反应。
由于未结合的NADH寿命在约300ps至500ps的范围内,我们需要仪器响应函数(IRF)低于这个荧光寿命范围的探测器。Becker&Hickel最近的实验表明,使用SPC-150N和SPC-150NX TCSPC模块加上HPM-100-06和-07检测器所得到的IRF宽度小于20 ps。 这样快速的IRF不会干扰荧光衰减,数据分析中通常的反卷积过程实际上变成了一个简单的曲线拟合。
超快荧光寿命成像应用于皮肤癌早期检测
可以看到试验中检测系统的时间分辨率非常好。荧光的发生发生在不到两个时间通道上,表明IRF的确短于20 ps,这样显着提高了NADH FLIM的准确性。 IRF不再干扰快速荧光成分的衰变时间。
来自昆士兰大学的研究者同样结合多光子显微镜与FLIM利用细胞内自发荧光来监测代谢辅酶NADH的游离和蛋白结合形式的量的比例的成像。他们使用同基因黑色素瘤小鼠模型检测单一表皮细胞代谢状态的变化,作为监测肿瘤生长进展的代谢标记。通过三个不同的黑色素瘤病变生长阶段与正常的皮肤进行对比,他们发现随着固体黑素瘤肿瘤的生长自由结合的NADH比率显着增加,同时NADH的短寿命和长寿命组分保持不变。这些结果表明FLIM能够快速,非侵入性和敏感地评估黑色素瘤进展,揭示其作为黑色素瘤检测诊断工具的潜力,并作为黑色素瘤分期的辅助手段。
超快荧光寿命成像应用于皮肤癌早期检测
上图:不同小鼠黑色素瘤阶段的NADH的游离和蛋白结合形式的比率以及荧光寿命。
德国Becker&Hickl GmbH公司,时间相关单光子计数技术的领导者,成立于1993年,从创立之初便推出了革命性的时间相关单光子计数器,速度比传统的TCSPC技术快了上百倍。经过多年的发展,在用户实验需求的推动下,B&H公司提供了多维TCSPC技术,能够在短暂的实验过程中得到多维光子分布信息,如时间、波长、空间坐标、荧光寿命等等。在生命科学领域成功与各大显微镜公司合作,提供基于共聚焦显微镜的荧光寿命成像系统(FLIM)。另外,B&H公司也拥有自主开发的共聚焦显微FLIM系统,而且能够提供皮秒激光器、探测器及相关实验控制模块,产品种类丰富,应用领域广泛,极其适用单光子探测,荧光寿命成像等相关实验。
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