近些年来,一些诸如TIRF(全内角反射荧光显微镜,total internal reflection fluorescence microscope)和超高分辨率显微镜的技术亟须二向色镜具有更高的平整度,来减少相差并简化校准的难度与步骤。即使是有轻微弯曲的二向色镜都有会影响光学系统中的对焦,导致焦平面的位移以及图像质量的下降。Semrock最新推出的BrightLine™激光二向色镜比市面上所有的二向色镜都更为平坦,在保证各种光学性能的同时,平整度最高可以达到λ/10,可以为最为苛刻的光学系统提供更高的光通量以及更好的信号采集。

为什么平整度如此重要?

显微镜中的二向色镜主要用于对于不同波长光的分束。当使用二向色镜时,它不仅仅会影响光束的传播方向,还会影响它的波前。我们制作滤光片的时候会镀上薄膜来得到需要的过滤波段。涂层产生的应力会导致基材的轻微弯曲或者曲率的不同。二向色镜的弯曲对于反射的影响比透射大得多。对于透过二向色镜的光束而言,弯曲仅仅会导致轻微的色散,导致光束有可以忽略的像差。这也就解释了为什么传统的荧光显微镜为什么不重视平整度这个参数,因为发射信号是透过二向色镜的。二向色镜的轻微弯曲虽然在传统的光学系统上不会造成很明显的影响,但是会对更先进的显微系统的成像造成不可忽视的负面影响。这也就促使着滤光片厂家研发出更加适合先进显微系统的平整滤光片。

Semrock滤光片如何提升超分辨光学系统质量

弯折或者弯曲的二向色镜对于反射或者透射光束的光斑尺寸以及形状

Semrock滤光片如何提升超分辨光学系统质量

弯曲的二向色镜对于反射的光束具有聚焦的作用

对于任意一束从45°方向被二向色镜反射的光束而言,二向色镜自身的曲率都会导致光束有一个附加的聚焦作用,同时导致焦平面位置的改变。而聚焦点的大小或者形状也会发生改变。诚然我们可以通过改变探测器的位置来补偿发射光束的焦平面位移,但是这会导致图像质量的损失。

光学器件的平整度可以通过每英寸器件对于633nm光的波分数来标示。二向色镜的平整度的偏差主要是由于球面曲率的影响。球面曲率决定了二向色镜反射光束的焦平面偏移。当使用高斯光束的时候,聚焦的质量由瑞利范围判断,瑞利范围指的是指光束沿着其行进方向,从原始聚焦点到其面积为原始聚焦点面积两倍的截面的距离,此时截面半径约为1.414倍的聚焦点半径。光束(或者一个成像点)在聚焦点的一个瑞利范围内仍然可以视为是聚焦的,这使其成为评判二向色镜曲率的一个有效的指标。如果聚焦点的偏移小于一个瑞利范围,我们便可以忽略这个误差。

如果二向色镜存在弯曲,当它以45°角反射时,产生的主要相差是散光,这会导致其在不同的方向(横向和纵向)产生两个不同的非对称的焦点。虽然光束没有完全的聚焦,但是我们可以在两个焦点之间找到一个折中—即在图像和更大焦斑之间成为模糊的中点中找到,这个点我们一般称之为最小模糊圈。

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由于二向色镜的曲率导致反射产生两种不同的焦点,中点是“最小模糊圈”

如果二向色镜的曲率变大的话,散光的影响也会变小。以直径为11 mm的光束为例,当二向色镜的曲率半径大于150m的时候横向和纵向的焦点就会非常相似。我们可以通过二向色镜的曲率半径(R)和成像透镜的焦距(fTL)计算得到最小模糊圆的几何尺寸半径。对于非常大的曲率半径而言,光束尺寸的增长只会引起很小的散光。

Semrock滤光片如何提升超分辨光学系统质量

当散光是相差的主导因素时,三阶或者更高阶的像差也会在聚焦或者成像的透镜后面降低准直光束的质量。而二向色镜更加平整的话,会有效的降低最小模糊圈的大小。

平整度对于实际应用的影响

在TIRF中,二向色镜反射照明和激发光束到达样品,所以二向色镜的平整度会对光束质量产生影响。二向色镜更加平整的话,可以提供在样品表面更加均一的照明,降低背景噪音。如果TIRF的照明光束很小,比如直径只有数毫米或者更小,二向色镜的曲率半径对于最佳的聚焦光束的形状和尺寸影响不大。而焦点的位置则不同,当激光在TIRF显微镜上被二向色镜反射的时候,光束必须被物镜的背焦平面反射。弯曲的二向色镜会改变焦平面,所以如果显微镜中对于激光准直的调节不够精确,这很难达到成功的TIRF激发。而TIRF技术是诸如PALM和STORM这样的超分辨成像技术的基础,所以以TIRF技术为基础的种种超分辨成像技术都有对于高平整度二向色镜的需求。下图就是使用Semrock超平二向色镜构建的多波长STORM系统。

Semrock滤光片如何提升超分辨光学系统质量

使用Semrock超平二向色镜构建的多波长STORM系统

不仅仅是TIRF显微,对于具有宽波段以及激光激发的结构照明显微镜,因为蒙板必须在激发光照射在样品的光路上成像,所以对于焦平面位移的补偿可能会带来问题。如果二向色镜的平整度不够的话,由于照明成像光束的劣化,会导致网格无法在样品表面成像,或者得到一个质量足够好的超分辨图像。下图就是中国科技大学的储开芹老师使用Semrock超平滤光片构建的SIM系统。

如果考虑实际的应用,因为焦平面位移以及散光会因为光束尺寸的增加而增加,光束尺寸在确定我们需要的平整度时扮演了一个很重要的角色。某种滤光片或许对于使用较小光束的科研工作者是一个足够平整的滤光片,但是对于另外的科研工作者而言,由于其使用的光束直径较大,也许就不再适用。

Semrock滤光片如何提升超分辨光学系统质量

采用Semrock超平滤光片的SIM系统

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不同平坦度的二向色镜的干涉仪条纹图案(从左到右:3λ,1λ,λ/ 5 P-V RWE @ 633)。最终的平整度取决于涂膜应力,基材不规则性和机械安装应力。

Semrock的解决方案

 

由于使用TIRF和超分辨显微镜,或者使用科研工作者自己开发的高性能显微镜系统都是有使用更大光束的趋势,所以滤光片的平整度正在变得更加重要。Semrock全新改进的Brightline™二向色镜为这些应用提供了两种业界领先的解决方案:在厚度为1mm或者3mm的基材上具有同样的光谱表现。

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Semrock可以提供装配好的滤光片盒

在1mm厚的基材上,Semrock把激光二向色镜经过了重新设计,可以达到λ/2的PV平整度。这样的平整度可以让直径为10mm的光束在反射的时候产生的偏移不超过一个瑞利范围。超平的1mm厚二向色镜可以使用在标准的显微镜色块里面,同时还简化了在色块与最小化的光束之间的透过转换,这也就避免了在1mm与2mm的二向色镜之间转换的重新校准的问题。

当使用二向色镜时,安装的时候镜片可能会遇到很大的压力,从而降低了二向色镜的平整度,因此安装二向色镜的时候需要保持好二向色镜的平整度。在3mm厚的基材上,Semrock可以提供λ/10平整度的成品,这样可以使22.5mm直径的光束的偏移不超过1个瑞利范围。这些3mm厚的二向色镜是设计高质量超分辨显微镜系统的科研工作者的首选,因为他们需要要用更大的光束来得到最好的图像质量。下表就是Semrock不同标准的二向色镜。

Semrock滤光片如何提升超分辨光学系统质量

参考文献

Ma, Y, Guo, S, Pan, Y, et al. Quantitative phase microscopy with enhanced contrast and improved resolution through ultra‐oblique illumination (UO‐QPM). J. Biophotonics. 2019; 12:e201900011. 

Dempsey, Graham T . [Methods in Cell Biology] Digital Microscopy Volume 114 || A User’s Guide to Localization-Based Super-Resolution Fluorescence Imaging[J]. 2013:561-592.