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使用 VALO 540nm 绿色飞秒激光进行色氨酸的双光子 FLIM 研究
色氨酸是一种必需氨基酸，它与其他氨基酸一起，是大多数蛋白质的组成部分。色氨酸具有荧光性，其荧光是蛋白质荧光的主要部分。色氨酸荧光取决于生物学参数，如蛋白质组成、蛋白质折叠以及较近分子环境中其他氨基酸的存在情况。这种依赖性使色氨酸成为生物系统中分子参数的潜在荧光标记物。特别是当通过荧光寿命成像（FLIM）检测色氨酸荧光时，情况更是如此。问题在于，色氨酸的激发波长处于深紫外区域，普通显微镜无法达到。在本文中，我们展示了如何通过时间相关单光子计数荧光寿命成像（TCSPC FLIM）结合新型绿色飞秒激光的双光子激发来获取色氨酸寿命图像。图1：显示色氨酸荧光的酵母细胞的荧光寿命成像显微镜（FLIM）图像。在540纳米处进行双光子激发，在320至380纳米范围内进行检测。色氨酸荧光色氨酸（TRP）荧光成像的问题在于其激发光和发射光的波长都处于紫外波段。最大激发波长约为280纳米，发射光波段范围约为300纳米至400纳米。色氨酸的吸收光谱和发射光谱如图2所示。图2：色氨酸的吸收光谱（左）和发射光谱（右）（数据来自[9]）通过传统荧光技术，色氨酸荧光只能在传统荧光光谱仪或配备特殊紫外物镜的类似装置中记录。通过这种方式，可以获得荧光衰减曲线。在普通显微镜中，无法直接激发色氨酸，因为所需的激发波长无法通过显微镜光学系统。在激光扫描显微镜中，这个问题更为严重，因为激发光还必须通过扫描器光学系统。一种有望避免紫外问题的方法是使用多光子激发。研究表明，三光子（3 - p）激发可以获得有用的结果。对于3 - p激发，使用的波长范围是750纳米至840纳米。合适的波长可以很容易地从钛宝石激光器中获得。乔恩蒂库马尔等人发表了3p激发色氨酸成像的早期研究结果。作者使用了配备abh SPC - 152荧光寿命成像（FLIM）系统的蔡司LSM 780。他们发现，当用葡萄糖处理细胞时，结合态NADH浓度增加会导致色氨酸（TRP）寿命缩短。阿拉姆等人使用类似系统记录前列腺癌（PCa）细胞中NAD（P）H、FAD和TRP荧光的寿命图像，并量化细胞对阿霉素治疗的代谢反应。 不幸的是，色氨酸的3p激发存在一个潜在问题。3p激发需要高激光功率，在焦平面上通常超过10毫瓦。这对于色氨酸溶液来说不成问题，但在细胞中却是个问题。细胞中含有NADH和FAD。在740纳米至840纳米波长范围内，激光以双光子激发的全部功率击中这些辅酶的吸收带，见图3。在740纳米波长处使用7毫瓦至8毫瓦的功率。这明显高于通常用于NADH和FAD成像的功率，几乎肯定会对细胞造成损伤。从细胞的色氨酸发射带获得的计数率约为每秒不到10000个计数。另一种可能性是通过双光子（2p）激发来激发色氨酸。色氨酸的最佳激发波长将在530至560纳米范围内。如图3所示，NADH或FAD在该波长下没有明显吸收。因此，可以预期光损伤将保持在可接受的水平。直到最近，问题在于没有合适的具有所需波长的飞秒激光器。现在，已经推出了波长为540纳米的飞秒激光器。这促使我们尝试使用2p激发对色氨酸进行双光子荧光寿命成像（FLIM）。图3：多光子激发对瞬时受体电位通道（TRP）的激发。红色：825纳米激光。绿色：825纳米激光。可以看出，825纳米的三光子激发也会激发黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。540纳米的双光子激发则不存在这个问题。双光子色氨酸荧光寿命成像系统我们的色氨酸系统基于标准的Becker & Hickl DCS-120 MP多光子荧光寿命成像系统。其原理如图4所示。光学部分由一个bh
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