使用 VALO 540nm 绿色飞秒激光进行色氨酸的双光子 FLIM 研究

色氨酸是一种必需氨基酸，它与其他氨基酸一起，是大多数蛋白质的组成部分。色氨酸具有荧光性，其荧光是蛋白质荧光的主要部分。色氨酸荧光取决于生物学参数，如蛋白质组成、蛋白质折叠以及较近分子环境中其他氨基酸的存在情况。这种依赖性使色氨酸成为生物系统中分子参数的潜在荧光标记物。特别是当通过荧光寿命成像（FLIM）检测色氨酸荧光时，情况更是如此。问题在于，色氨酸的激发波长处于深紫外区域，普通显微镜无法达到。在本文中，我们展示了如何通过时间相关单光子计数荧光寿命成像（TCSPC FLIM）结合新型绿色飞秒激光的双光子激发来获取色氨酸寿命图像。

图1：显示色氨酸荧光的酵母细胞的荧光寿命成像显微镜（FLIM）图像。在540纳米处进行双光子激发，在320至380纳米范围内进行检测。

色氨酸荧光

色氨酸（TRP）荧光成像的问题在于其激发光和发射光的波长都处于紫外波段。最大激发波长约为280纳米，发射光波段范围约为300纳米至400纳米。色氨酸的吸收光谱和发射光谱如图2所示。

图2：色氨酸的吸收光谱（左）和发射光谱（右）（数据来自[9]）通过传统荧光技术，色氨酸荧光只能在传统荧光光谱仪或配备特殊紫外物镜的类似装置中记录。通过这种方式，可以获得荧光衰减曲线。在普通显微镜中，无法直接激发色氨酸，因为所需的激发波长无法通过显微镜光学系统。在激光扫描显微镜中，这个问题更为严重，因为激发光还必须通过扫描器光学系统。一种有望避免紫外问题的方法是使用多光子激发。研究表明，三光子（3 - p）激发可以获得有用的结果。对于3 - p激发，使用的波长范围是750纳米至840纳米。合适的波长可以很容易地从钛宝石激光器中获得。乔恩蒂库马尔等人发表了3p激发色氨酸成像的早期研究结果。作者使用了配备abh SPC - 152荧光寿命成像（FLIM）系统的蔡司LSM 780。他们发现，当用葡萄糖处理细胞时，结合态NADH浓度增加会导致色氨酸（TRP）寿命缩短。阿拉姆等人使用类似系统记录前列腺癌（PCa）细胞中NAD（P）H、FAD和TRP荧光的寿命图像，并量化细胞对阿霉素治疗的代谢反应。

不幸的是，色氨酸的3p激发存在一个潜在问题。3p激发需要高激光功率，在焦平面上通常超过10毫瓦。这对于色氨酸溶液来说不成问题，但在细胞中却是个问题。细胞中含有NADH和FAD。在740纳米至840纳米波长范围内，激光以双光子激发的全部功率击中这些辅酶的吸收带，见图3。在740纳米波长处使用7毫瓦至8毫瓦的功率。这明显高于通常用于NADH和FAD成像的功率，几乎肯定会对细胞造成损伤。从细胞的色氨酸发射带获得的计数率约为每秒不到10000个计数。

另一种可能性是通过双光子（2p）激发来激发色氨酸。色氨酸的最佳激发波长将在530至560纳米范围内。如图3所示，NADH或FAD在该波长下没有明显吸收。因此，可以预期光损伤将保持在可接受的水平。直到最近，问题在于没有合适的具有所需波长的飞秒激光器。现在，已经推出了波长为540纳米的飞秒激光器。这促使我们尝试使用2p激发对色氨酸进行双光子荧光寿命成像（FLIM）。

图3：多光子激发对瞬时受体电位通道（TRP）的激发。红色：825纳米激光。绿色：825纳米激光。可以看出，825纳米的三光子激发也会激发黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。540纳米的双光子激发则不存在这个问题。

双光子色氨酸荧光寿命成像系统

我们的色氨酸系统基于标准的Becker & Hickl DCS-120 MP多光子荧光寿命成像系统。其原理如图4所示。光学部分由一个bh DCS - 120扫描头、一台尼康Ti 2E显微镜、一台带有二次谐波产生（SHG）选项的560 nm VALO Aalto激光器[11]以及两个HPM - 100混合探测器组成。其原理如图4所示。该激光器在540 nm波长处提供50 mW的光功率。激光束通过一个快门和一个可变衰减器。扫描由DCS - 120 MP扫描头完成。扫描头的扫描透镜将激光束沿着显微镜光路向下投射到显微镜物镜上。为了在激发和检测方面都获得高效率，我们使用了一个放大倍数为40倍、数值孔径NA = 1.3的油浸物镜。荧光通过显微镜物镜收集回来，通过显微镜滤光轮中的520 nm二向色分束器与激发光分离，并通过显微镜的后端口输出。光通过常规的NDD（非扫描检测）光路传输到探测器。散射的激光通过一个500 nm短通滤光片去除。DCS系统有两个探测器。对于色氨酸记录，我们仅使用其中一个。检测到的信号进一步通过一个360/40带通滤光片进行净化。该信号通过DCS - 120系统的两个SPC - 180NX荧光寿命成像（FLIM）模块[3]之一，由bh的多维时间相关单光子计数（TCSPC）FLIM程序[2, 3, 5]进行记录。更多细节请参见[3, 4]。

实验结果

图5展示了活酵母细胞的色氨酸寿命图像。样品平面内的激发功率为2毫瓦，采集时间为60秒。在该时间内，以每秒90×10³个光子的计数率采集到550万个光子。光子数量足以进行双指数衰减分析。光标位置的衰减成分分别为49%的632皮秒和51%的3525皮秒。幅度加权寿命为2108皮秒。

图5：酵母细胞的色氨酸荧光寿命成像。左图：寿命图像。双指数衰减的幅度加权寿命。右图：光标位置的衰减函数。图像格式为512×512像素，1024个时间通道，540纳米双光子激发，寿命范围为1000皮秒至4000皮秒。使用bh SPCImage NG9.0软件进行分析[6]。图6展示了活的大肠杆菌（E. coli）的色氨酸寿命图像。大肠杆菌并非易成像的目标。它们体积小且移动迅速。所示图像的采集时间为90秒。整幅图像包含约1000万个光子。该图像采用双指数衰减模型进行分析。光标位置处的衰减成分分别为1573皮秒的62.7%和4740皮秒的37.3%。幅度加权寿命为2762皮秒。

图6：大肠杆菌的色氨酸荧光寿命成像。左图：寿命图像。双指数衰减的幅度加权寿命。右图：光标位置的衰减函数。512×512像素，1024个时间通道，540纳米双光子激发，寿命范围从1000皮秒到4000皮秒。使用bh SPCImageNG 9.0进行分析[6]。

为作比较，图7展示了色氨酸在水溶液中的衰减曲线。这些数据是使用与上述荧光寿命成像显微镜（FLIM）数据相同的系统采集得到的，该曲线是通过将所有像素的数据合并到一条衰减曲线中创建出来的[6]。

图7：色氨酸在水中的衰减曲线。与荧光寿命成像（FLIM）图像使用同一系统记录。采集时间160秒，由bh SPCImage NG9.0分析。

该衰变由64.8%的2463皮秒成分和35.2%的3192皮秒成分组成，接近单指数形式。幅度加权寿命为2719皮秒。这些数值与从酵母细胞和大肠杆菌细胞中获得的寿命相符。这有力地表明，细胞的发射光确实来自色氨酸。细胞中的衰变函数更接近双指数（a1比溶液中更高，t1比溶液中更低），这一事实可以用色氨酸环境的不均匀性以及可能存在的从色氨酸到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的荧光共振能量转移（FRET）来解释。在前列腺癌细胞中已发现FRET现象，并且在酵母细胞和大肠杆菌细胞中似乎也有可能发生。尝试计算酵母细胞中假设的FRET效率，得到图8所示的FRET图像。左侧显示经典FRET效率的彩色编码图像，右侧显示光标位置处FRET效率和衰变参数的分布。最常见的FRET效率为0.46，这对于色氨酸 - 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的FRET来说是一个合理的值。

图8：假设的TRP-NADH能量转移的荧光共振能量转移（FRET）图像。左图：显示颜色编码（传统）FRET效率的图像。右图：像素上FRET效率的分布以及光标位置的衰减参数。由bh SPCImage NG 9.0进行分析。

Summary 总结

我们展示了一种荧光寿命成像（FLIM）系统，该系统能够记录活细胞中色氨酸（TRP）的寿命图像。该系统基于标准的bh DCS - 120 MP多光子FLIM系统[4]。与已知的三光子方法不同，该系统采用新型540纳米飞秒激光器进行双光子激发[11]。通过这种方式，可避免因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的不必要激发而造成的光损伤。我们通过记录大肠杆菌细胞和酵母细胞的TRP图像，展示了该系统的应用。样品平面的激发功率约为3毫瓦，TRP发射波段的计数率约为每秒90,000至100,000个光子。衰减函数为双指数形式，酵母细胞的成分分别为632皮秒和3525皮秒，大肠杆菌细胞的成分分别为1573皮秒和4740皮秒。溶液中TRP的寿命成分分别为2463皮秒和3192皮秒。

References

如果您对于上面描述的BH的FLIM系统或者 540nm Valo 飞秒激光感兴趣可以联系大侦探咨询！