多光子显微镜无需染料或荧光标记即可实现高分辨率三维生物成像，深刻改变了生物成像领域。这一进步的核心在于超短飞秒激光脉冲的运用。此类短脉冲能够减少光照暴露，显著降低成像过程中的光损伤，这在活体样本研究中尤为关键，使研究者在保持样本活性的同时获取精细图像。
超快飞秒激光器的脉冲持续时间远短于传统系统，可在保持较低平均功率的同时提供更高的峰值功率。这种特性增强了成像对比度，并减少了样品的热暴露，对维持成像过程中生物样本的完整性至关重要。短脉冲持续时间可将光损伤和光漂白降至较低水平，因此此类激光器适用于活细胞和组织的长期研究。
40 fs以下的亚短脉冲具备的峰值功率，对驱动非线性光学过程必不可少，包括双光子激发（2PE）、二次谐波产生（SHG）、三光子激发（3PE）和三次谐波产生（THG）。这些过程的信号强度与入射光强度的平方或立方成正比。借助这些技术，可对分子和结构特征进行精确的、无需标记的成像。
二次谐波产生是一种相干非线性过程，发生在胶原纤维、微管等非中心对称结构及其他有序生物组装体中，因此SHG特别适用于以较高特异性和对比度对结缔组织、细胞骨架成分和纤维状蛋白成像。三次谐波产生则出现在折射率失配的界面或材料不均匀区域，可对细胞膜、富含脂质的结构域和细胞器边界进行细致的可视化呈现。通过整合这些非线性成像模式，研究者能够从生物样本中提取丰富的多维信息，深入理解细胞结构与功能。
短脉冲激光器提升三光子效率
由于多光子激发效率强烈依赖于脉冲期间入射光的峰值功率，脉冲越短，峰值功率越高，产生的多光子信号越强。迄今为止，产生80 fs以下超短且纯净脉冲的能力相对有限。
VALO飞秒系列激光器提供了一种突破该限制的新途径，可获得更短（低于50 fs）且纯净的脉冲。多光子事件效率与激光峰值功率呈非线性关系：双光子和三光子过程的信号分别随入射光峰值功率的平方和立方增长。例如，将脉冲持续时间从200 fs缩短至50 fs，峰值功率提高4倍，双光子效率提升至4倍，三光子效率提升至16倍。
飞秒脉冲的另一优势在于提高双光子荧光效率。高峰值功率增强了非线性相互作用，从而提高荧光效率，使研究者用更少的光子即可获得高分辨率图像，降低了对高激光功率的需求，并减少光损伤。此外，短脉冲持续时间与高峰值功率相结合，可在三维空间实现高分辨率成像，支持细胞及亚细胞水平的研究。
简言之，更短的激光脉冲意味着更高的峰值强度，可显著增强成像信号：双光子效率（2PE）信号随脉冲缩短可增至5倍，三光子效率（3PE）信号最高可增至25倍。这些增益不仅改善图像质量，还减少热量产生和光漂白，使活细胞长期成像更安全、稳定。
亚50 fs脉冲对三光子成像的重要性
为从实验上验证短脉冲的优势，需要在样本处准确测量脉冲持续时间。若显微镜光学系统缺乏适当的色散补偿，脉冲会展宽，导致焦点处峰值功率下降，从而削弱高阶谐波产生的效率，使实验验证不可靠。
要在保持适合活体样本的温和平均功率的同时产生强非线性信号（如SHG和THG），亚50 fs脉冲与有效的色散预补偿缺一不可。这些条件可确保足够的信噪比，同时不损害样本完整性。
实验对比显示：使用VALO飞秒系列激光器全带宽（约40 fs脉冲）、样品上平均功率4.7 mW时，校准网格可产生清晰的三次谐波信号；而当光谱带宽限制在1064 nm附近10 nm（约160 fs脉冲）时，即使平均功率提高至6 mW，仍无法在实验噪声本底之上直接获得THG图像，需将信号重新标定放大方可成像。要获得与亚50 fs短脉冲相当的信噪比，长脉冲需要约2.5倍的激光平均功率。
超快激光器支持高阶非线性成像
与传统飞秒激光系统相比，VALO超短脉冲激光器可产生宽达1140 nm的更宽光谱，深入近红外波段。更宽的带宽不仅支持二次谐波产生和双光子激发等过程，还能激发三光子激发和三次谐波产生等更复杂的非线性现象。
其原理在于：标准显微物镜的透过特性决定了THG信号须由1080 nm以上的波长产生方能有效透过物镜被探测；而传统约1 μm波长的激光产生的THG信号位于紫外波段，往往因波长过短而无法透过标准物镜。因此，这类新型激光系统的超宽光谱带宽支持2PE、SHG、THG和3PE的同时产生与探测。
多光子显微镜在癌症实时诊断中的应用
多光子显微镜颇具前景的应用方向之一是癌症研究，尤其是癌症诊断。传统活检分析可能需要数天，而高阶谐波产生（HHG）成像可在数分钟内给出结果。近期一项研究表明，活检组织在离体后仅六分钟即可完成成像与分析，准确率为87%。
该技术在支气管镜检查等获取足量诊断组织较为困难的操作中尤具价值。HHG成像可提供即时反馈，有望减少重复操作的需求。源自阿姆斯特丹自由大学的初创企业Flash Pathology正在开发用于临床的紧凑型HHG显微镜，其目标是将近实时、无标记的组织成像引入医院。该集成VALO飞秒激光器的移动式显微镜可直接运至手术室使用。
结论
在多光子显微镜中采用超短飞秒脉冲具有多重优势，包括降低光损伤、提高效率、改善空间分辨率以及减少背景信号。尤其是低于50 fs的超短脉冲提供了显著更高的脉冲峰值功率，可在更低的平均功率下获得理想信噪比的图像，进而减少光漂白、延长细胞活性。这些优势使多光子显微镜成为生物样本研究的重要工具，帮助研究者以较低光损伤获取高分辨率图像。
参考文献
相关研究发表于Journal of Biomedical Optics（2006，脉冲持续时间对双光子激发荧光与二次谐波产生的影响）、Scientific Reports（2018，压缩飞秒脉冲持续时间对经内镜双光子激发神经元组织的影响）及Photonics Views（2025，激光揭示细胞奥秘）等学术期刊。
相关产品
VALO飞秒系列为超快飞秒光纤激光器，脉冲持续时间低至30 fs，功率可达3 W，配有计算机控制的群速度色散预补偿功能，适用于多光子显微镜、双光子聚合和光遗传学等应用。
