DCS-120 共焦 FLIM 系统

DCS-120 共焦 FLIM 系统专业产品介绍

产品概述

Becker & Hickl 推出的 DCS-120 共焦 FLIM 系统是一套完整的共焦激光扫描荧光寿命成像显微镜系统，采用 ps 二极管激光器激发、振镜快速扫描、共焦检测和 bh 的多维 TCSPC 技术进行 FLIM 记录。该系统以前所未有的时间分辨率、前所未有的重现性、高空间分辨率、高灵敏度和接近理想的光子效率记录荧光寿命图像。荧光寿命可检测到 25 ps，衰变数据可解析为 4096 个时间通道，宽度可达 405 fs，像素格式可增至 2048 × 2048。系统包含显微镜和激光器，同时也可用于将现有的传统显微镜转换为带有 TCSPC 检测功能的全功能共聚焦或多光子激光扫描显微镜。

系统兼容性与功能特性

DCS-120 系统可用于尼康、蔡司和奥林巴斯的倒置显微镜。由于其光束扫描速度快、灵敏度高，该系统可用于活细胞成像。系统功能包括在两个完全平行的波长通道中同时记录 FLIM 或稳态荧光图像、激光波长复用、多波长 FLIM、时间序列 FLIM、通过时间马赛克 FLIM 进行超快速时间序列记录、空间马赛克 FLIM、Z-Stack FLIM、磷光寿命成像（PLIM）、荧光寿命瞬时扫描（FLITS）和 FCS 记录。

应用重点是代谢成像，即利用荧光团与其分子环境相互作用所产生的寿命变化。典型应用包括离子浓度测量、FRET 实验、代谢成像、快速生理效应成像和植物生理学。

系统原理与操作模式

系统基于快速振镜激光扫描、去扫描共焦检测（DC）和 bh 的多维 TCSPC FLIM 技术。激发采用 ps 脉冲激光器，经光纤耦合输入，扫描速率可低至约 1 μs/pixel。系统支持的操作模式涵盖两个（多）光谱或偏振通道、时间序列、Z-堆栈、马赛克（X、Y、Z、时间）、激发波长多路复用、FLITS（荧光寿命-瞬态扫描）、与 FLIM 同时进行的 PLIM（磷光寿命成像）、光子相关（FCS、FCCS、门控 FCS），以及单点荧光和磷光衰减测量。

扫描头与光学系统

扫描头采用快速振镜激光扫描光学原理，配备两个独立的光纤耦合激光输入。光学激光功率控制通过连续 ND 滤光片轮实现。激光输入要求为准直自由光束，或配有直径为 12 mm 准直器的光纤耦合光束，光束直径 1 至 2 mm。激光功率调节通过中性密度滤光片轮连续可变。扫描头通过适配器连接显微镜左侧端口或顶部端口。

共焦检测部分配备两个直接连接的探测器输出。主分光镜采用无需对准的可交换式分色镜，提供长通、多波段、宽波段和多光子选项。二级分光镜轮内含三个二向色分光镜、偏振分光镜，支持 100% 到通道 1 或 100% 到通道 2 的配置。每个通道设有独立的针孔轮，针孔对准通过电子方式经由压电微动平台实现，提供 11 个针孔从约 0.5 到 10 AU 的尺寸选择。每个通道串联两个滤光片滑块用于发射滤波。该系统可有效抑制散射和杂光。

扫描控制

扫描控制由硬件执行精确激光扫描，快速回扫实现快速采集。帧尺寸范围为帧扫描 16 × 16 至 4096 × 4096 像素，行扫描 16 至 4096 像素。X 扫描支持连续扫描或逐个像素扫描，Y 扫描为逐行扫描。系统支持软件控制带有模拟调制输入的激光器。激光多路复用支持帧、行、像素和像素内级别，需要软件控制激光功率。光束消隐在回扫期间和扫描停止时执行，同样需要软件控制激光功率。帧频和扫描速度可自动选择最快速率或手动选择，并提供交互式扫描区域选择、硬件缩放与偏移、快速预览功能以及交互式测量点选择的光束驻留功能。

TCSPC 系统配置

系统可选配两种 TCSPC/FLIM 模块。SPC-180NX 模块提供典型值 2 个、最多 4 个并行 TCSPC/FLIM 通道，电气时间分辨率为 1.6 ps RMS / 3.5 ps FWHM，定时精度为 1.1 ps，最小时间通道宽度为 405 fs，饱和计数率为 12 MHz。SPC-QC-104 模块提供典型值 2 个、最多 3 个并行通道，电气时间分辨率为 16 ps RMS / 小于 39 ps FWHM，定时精度为 11 ps，最小时间通道宽度为 4 ps，饱和计数率为 40 MHz（活动通道共享）。激光复用同步最多支持 4 个激光波长，多波长数据可通过路由功能在 16 个通道中同时记录。实验触发功能采用 TTL，用于 Z-Stack FLIM 和显微镜控制的时间序列。TCSPC 系统的操作模式包括硬件预分析成像、光子事件流（FIFO）成像、用于相关性的点测量与长时间尺度强度（MCS）、马赛克成像、时间序列成像、多探测器操作、激光多路复用操作、循环和重复功能以及自动保存功能。

激发源

共焦 FLIM 由 1 至 4 个 BDS-SM ps 二极管激光器激发，可用波长范围为 375 nm 至 785 nm，重复率为 20、50、80 MHz 和连续波，脉冲宽度为 40 ps 至 100 ps。可选配置包括多光子 FLIM、自由光束或光纤耦合飞秒脉冲激光器、单一波长或可调波长。

探测器选项

共焦检测器直接耦合到扫描头，可选 NDD 探测器直接耦合到显微镜后端口。标准配置为 HPM-100-40 混合探测器，带 GaAsP 阴极，波长 250 至 720 nm，最适合与 ns 寿命染料一起使用。可选 HPM-100-06 检测器，FWHM IRF 宽度小于 20 ps，波长 220 至 650 nm，最适合用于 ps 寿命的自发荧光研究。可选 HPM-100-50 检测器，波长 400 至 900 nm，最适合长波长荧光研究。另可选配 MW-FLIM GaAsP 多波长探测器。

软件与数据分析

数据采集软件为 bh SPCM，并配备用于集成外部设备的 bh LabVIEW，扫描仪控制软件集成在 SPCM 中。系统支持 Windows 10/11 64 位操作系统，并配备集成式电动样品台。数据分析由 bh 最新的 SPCImage NG FLIM 分析软件执行，该软件是时域分析和相位分析的结合，通过在 GPU 上运行计算，几秒钟内即可得到结果。其他功能还包括通过相位图或二维时域直方图进行图像分割，以及系统 IRF 自动建模，因此无需通过记录实际 IRF 进行重复校准。函数模型包括 IRF 卷积单、双或三分量指数衰变、可选择考虑不完全衰减以及偏移分量模型，采用 MLE（最大似然估计）拟合衰变数据。

技术原理

DCS-120 系统采用共焦检测解决传统荧光显微镜的焦外模糊问题。显微镜物镜将激光束聚焦到样品中，来自激光束焦点的光通过显微镜镜头收集回来，通过二向色镜与激光束分离，并聚焦到与焦平面共轭的针孔中，只有来自焦平面的光才能通过针孔。共焦检测与快速振镜光束扫描相结合，不仅解决了离焦问题，还能避免样品中的散射光造成像素之间的横向串扰——扫描系统只记录当前像素的光，即使部分光在样品中散射，成像系统也会将散射光子分配到正确的像素上。

与 TCSPC FLIM 相结合时，通过针孔的单光子被检测到，激发脉冲周期内的光子时间和光子检测时刻的激光束位置也被确定，并在这些参数上建立光子分布，结果是一个像素阵列，每个像素包含大量连续时间通道中的光子数。TCSPC-FLIM 记录过程可在任何扫描速率下工作，实现近乎理想的光子效率，信噪比只取决于样本的光子率和总的采集时间。通过增加光子分布的额外维度，可以积累多波长 FLIM 图像、多激发波长图像、荧光/磷光组合图像以及样品中快速生理效应的图像。