代谢成像系统

代谢成像系统专业产品介绍

产品概述

Becker & Hickl 推出的代谢成像系统是一套舒适、无标签、近乎瞬时的双光子代谢成像系统，具有 B&H 传奇般的终身精度。这款交钥匙 FLIM 显微镜的配置可让您获得开箱即用的最佳效果，配备了 TOPTICA 最新的交钥匙飞秒脉冲激光器，用于 NADH 和 FAD 激发，能以无与伦比的价格提供大学和临床所需的结果。

核心性能配置

系统配备两台 TOPTICA FemtoFibre Ultra 飞秒光纤激光器，分别输出 780 nm 和 920 nm 激发波长，功率约为 1 W，脉冲宽度小于 100 fs，重复频率为 80 MHz，集成 AOM 与 GDD 控制，支持波长复用激发。在时间分辨性能方面，系统提供超精确寿命测量，仪器响应函数约为 20 ps，时间通道宽度低至 213 fs，定时抖动为 3 ps，支持并行双通道采集。最大检测波长范围为 250 nm 至 720 nm，其中 NADH 检测波段为 420 nm 至 480 nm，FAD 检测波段为 500 nm 至 550 nm。

基本功能

代谢成像系统提供全电动样品台，支持 4D Z 堆栈 FLIM 视频速率记录（配备 Express FLIM，取决于时间标记单元的选择）。系统实现无缝分析集成，包括相位图分析、按寿命分割图像以及 FCS 分析功能。采集模式涵盖区域和线扫描模式，以及用于相关测量的真实点测量。系统配备快速激光扫描单元以实现最佳图像采集效果，并提供为实验选择的基本检测滤波器套件。

可选配置

用户可按需选择不同的单光子混合探测器，并可选用带可选环境控制的培养箱，以满足活细胞工作的实验需求。

技术原理：通过 NAD(P)H 和 FAD 的荧光确定代谢状态

bh 多光子代谢荧光成像系统通过精确记录 NAD(P)H 和 FAD 的衰变函数来确定活细胞和组织的代谢状态。与早期的 NADH 实验不同，该系统不是根据 NAD(P)H 或 FAD 的寿命，而是根据它们的双指数衰变曲线各分量的振幅来确定组织状态。通过激光多路复用技术将两种荧光信号近乎完美地分离，从而提高了结果的可靠性。飞秒光纤激光器的多光子激发可到达组织深层，对活细胞非常友好。结合 bh SPCImage NG 数据分析的先进功能，可获得代谢状态的定量信息。

除了单个代谢状态图像外，该系统还能记录组织样本的 z 叠加图像，以及几秒、几小时甚至几天的代谢参数时间序列。虽然该系统针对代谢 FLIM 进行了优化，但并不局限于此。利用两个激发波长，它还能记录来自各种分子探针的 FLIM 数据，提供高质量的 pH 图像、钙图像、氯化物图像、FRET 图像和 SHG 图像。

光谱背景

NAD(P)H（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）和 FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）是参与细胞新陈代谢的辅酶。NAD(P)H 和 FAD 都有荧光。FAD 尤其是 NAD(P)H 的独特之处在于，它们的荧光强度和荧光衰减函数可以直接反映细胞的新陈代谢状态：NAD(P)H 和 FAD 的荧光寿命取决于与蛋白质的结合情况。未结合的 NAD(P)H 的荧光寿命约为 0.3 至 0.4 ns，结合的 NAD(P)H 的荧光寿命约为 1.2 ns。对于 FAD 而言，结合的效果正好相反：结合的 FAD 的寿命为几百 ps，未结合的 FAD 的寿命为几 ns。NAD(P)H 和 FAD 的结合/非结合比例会随着新陈代谢的类型而改变。优先进行氧化磷酸化的细胞（健康细胞）有更多结合的 NAD(P)H 和 FAD，优先进行糖酵解的细胞（肿瘤细胞）有更多未结合的 NAD(P)H 和 FAD。

早期确定代谢状态的尝试

近二十年来，人们一直试图从细胞或组织的简单荧光寿命中获取代谢信息。这些尝试失败的原因有两个。首先，NAD(P)H 和 FAD 的荧光信号没有明确分离。然而，新陈代谢引起的 NAD(P)H 和 FAD 的寿命变化方向相反，因此净寿命的变化是不可预测的，不能作为代谢状态变化的指标。其次，衰变成分的寿命取决于与代谢状态无关的细胞参数。因此，细胞和组织的净荧光寿命不能作为代谢状态的定量指标。

bh 的代谢 FLIM 技术

bh 的代谢 FLIM 技术与早期方法的不同之处在于以下两点。第一，干净利落地分离 NAD(P)H 和 FAD 的荧光信号，分离是通过在激发端结合激发-波长复用和在检测端结合光谱过滤来实现的。第二，使用 NAD(P)H 和 FAD 衰变曲线的衰变分量的振幅来代替寿命。衰变分量的振幅 a1 和 a2 代表结合和非结合 NAD(P)H 和 FAD 的比例，它们不受与环境有关的组分寿命的影响。分量振幅（或振幅比）定量地代表了新陈代谢状态，这一结果在很大程度上与细胞类型无关。健康细胞的 a1 低于 0.7，肿瘤细胞的 a1 高于 0.7。

让代谢 FLIM 发挥作用

提取衰变成分的振幅需要准确记录图像像素中的衰变数据和可靠的 FLIM 数据分析。bh 解决了这两个问题。bh TCSPC FLIM 模块的定时稳定性优于几皮秒，衰变曲线被解析为大量的时间分段，建议新陈代谢 FLIM 使用 1024 个时间分段。HPM-100 混合探测器具有干净的 IRF，没有凹凸和二次脉冲，探测器没有后脉冲，因此记录背景非常低，这些特点大大提高了 FLIM 数据分析的准确性。数据分析由 SPCImage NG 执行，SPCImage 的 MLE 拟合即使在光子数较低的情况下也能获得高度精确的成分寿命和振幅。智能分档、图像分割功能和全局拟合功能进一步提高了精确度。

双光子激发

标准的 DCS-120 共焦 FLIM 系统也可以进行代谢 FLIM，唯一的要求是安装了合适的激光器。然而，NAD(P)H 需要 375 nm 或更短的激发波长，这么短的波长无法深入生物组织，这就限制了对细胞或单细胞层的成像。因此，bh 代谢 FLIM 成像仪使用双光子激发。NAD(P)H 的激发波长为 780 nm，FAD 的激发波长为 920 nm，这些波长可穿透组织达 100 μm。荧光通过非扫描检测光束路径进行检测，这样即使光子在离开组织时发生散射，也能被有效检测到。