——无需染料，120nm分辨率，极低光毒性，开启活细胞成像新篇章
近日，斯坦福大学W. E. Moerner教授团队在《Light: Science & Applications》期刊发表了一项突破性研究成果——干涉图像扫描显微技术（iISM）。该技术首次将干涉散射显微镜与图像扫描显微术相结合，在活细胞内部实现了约120nm的横向分辨率，同时将所需照明功率降低至传统方法的十分之一。值得一提的是，该项研究中使用的445 nm激光器，正是来自Cobolt公司。
从“有毒”的荧光到“温和”的无标记成像
在生命科学领域，光学显微镜是不可或缺的研究工具。传统荧光成像虽然能够清晰地标记特定分子，但荧光染料的引入常常伴随着光毒性、标记效率受限以及对生物功能的干扰等问题。多年来，科学家们一直期待一种能够在不损伤活细胞的前提下，依然保持高分辨率和高对比度的成像方法。
干涉散射显微技术（iSCAT）的出现为这一目标提供了可能。该技术通过检测纳米结构对光的散射信号，无需任何染料或遗传标记即可实现高灵敏度探测。然而，将iSCAT应用于活细胞成像面临一个核心挑战：细胞内部复杂的异质结构会产生散斑噪声，严重降低图像质量。此前虽有研究通过共聚焦照明和探测方案在一定程度上解决了这一问题，但成像所需的光照功率仍然较高，制约了其在敏感细胞样本上的应用。
iISM：三项技术的巧妙融合
Moerner教授团队开发的干涉图像扫描显微技术（iISM），巧妙地将三项关键技术融为一体：干涉散射检测提供无标记对比度，图像扫描显微术提升分辨率，以及研究团队专门开发的适应性强像素重分配算法（APR）处理相干信号。
这套系统的核心光源正是Cobolt MLD-06-01型445 nm二极管激光器。在整个实验过程中，该激光器为系统提供稳定的445 nm照明光，经过单模光纤空间滤波后，通过偏振分束器和四分之一波片转换为圆偏振光，最终聚焦到样本平面。研究团队之所以选择圆偏振光，是因为其能够在高数值孔径条件下提供更好的旋转对称性，这直接关系到最终成像的分辨率和信噪比。论文中的实验数据清晰表明，采用圆偏振光后，照明点扩散函数的各向同性得到显著改善，为实现精准的像素重分配奠定了光学基础。
活细胞内细胞器的清晰呈现
凭借iISM技术，研究团队成功实现了对COS-7活细胞内多种细胞器的无标记成像，包括内质网、线粒体、囊泡、肌动蛋白细胞骨架、质膜以及片状伪足等结构。这些细胞器在图像中清晰可辨，而且有趣的是，同一类型的细胞器可能呈现出正对比度或负对比度，这反映了它们相对于光学切面的微小轴向位置差异，体现了iISM对纳米级三维形貌的固有灵敏度。
在时间序列成像中，研究团队以约8.2秒每帧的速度连续记录了囊泡运动和内质网重塑的动态过程。红色箭头标记的囊泡在细胞质中迁移，内质网小管发生动态重组，这些精细的生物学过程均在无标记、低损伤的条件下被忠实记录。值得注意的是，iISM成像的帧率仅受相机读取速度的限制，不存在荧光光物理上限的约束，这为其在快速动态过程研究中的应用打开了广阔空间。
研究团队还进一步验证了iISM与荧光成像的互补性。在固定细胞实验中，他们分别获取了同一区域的iISM无标记图像和Alexa Fluor 647标记的肌动蛋白荧光图像，叠加结果显示两者具有极好的空间对应关系。更有意义的是，iISM图像还揭示了一些荧光通道中不可见的未标记结构，如黏着斑和相邻囊泡，凸显了无标记散射对比度所提供的额外结构信息。
对于现有的商业共聚焦荧光IS显微镜系统，iISM可通过相对简单的光学改造实现：将主二色镜替换为偏振分束器，并在光路中加入四分之一波片即可。这意味着该技术具有较低的转化门槛，有望快速进入商业应用阶段。从更广阔的视角来看，研究者展望了将iISM与单分子荧光IS显微镜结合的混合策略。这种策略有望将超灵敏散射检测与分子特异性融为一体，为细胞结构和功能研究提供前所未有的信息维度。
Moerner教授团队的这项研究，标志着无标记活细胞成像技术迈出了重要一步。通过将干涉检测与图像扫描显微术创造性地结合，iISM在保持约120纳米高分辨率的同时，将照明功率需求降低至传统方法的十分之一，实现了真正意义上的低损伤、长时间活细胞观察。在这一突破性系统中，Cobolt MLD-06-01激光器凭借其稳定的性能和优异的输出质量，为核心实验提供了可靠的光源保障，助力科学家们在近乎天然的生理条件下，窥见细胞内纳米尺度的动态世界。
